Disséquant la dynamique de la réaction des protéines dans les cellules vivantes par la récupération de fluorescence après nature photoblanchiment protocoles de recherche de la nature

Les protéines dans les complexes ou les plus organites macromoléculaires tournent en continu sur récupérer le fichier Excel 2007 non enregistré. Il en résulte le chiffre d’affaires de réactions d’association et de dissociation qui sont médiées par chacun des domaines fonctionnels de la protéine. Ainsi, l’étude organite ou formation macromoléculaire à partir de la base en utilisant des approches de modélisation théorique et de calcul nécessitera la détermination de tous ces taux de réaction in vivo. Cependant, les méthodes actuelles pour l’examen de la dynamique des protéines soit des équipements hautement spécialisés nécessitent ou se limitent à des mesures de base. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode largement applicable en fonction de la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) pour déterminer le nombre de processus de réaction participent au chiffre d’affaires de toute protéine donnée d’intérêt, pour caractériser leurs taux d’association et de dissociation apparente, et pour déterminer leur parent importance dans le chiffre d’affaires de la population globale en protéines.


Des expériences ont été effectuées dans des cellules de mélanome exprimant M2 formes mutantes de l’ezrine qui fournissent un lien entre la membrane plasmique et le cytosquelette d’actine corticale. Nous décrivons également une stratégie générale pour l’identification des domaines de protéines qui interviennent dans chacun des processus de roulement identifiés. Notre protocole utilise largement disponibles microscopes confocale à balayage laser, des logiciels libres, des logiciels graphiques et techniques de biologie moléculaire communes. La préparation expérience entière FRAP, l’acquisition et l’analyse des données nécessitent 3-4 d.

(A) des expériences de photoblanchiment sont réalisées dans une ROI de cercle centré sur un organite d’intérêt et comprenant une région cytoplasmique. L’imagerie est effectuée dans un ROI circulaire (Iroi, cercle gris) entourant la ROI (cercle bleu), avec un rayon plus grand que le rayon de la ROI. L’exemple représenté ici (à droite) montre un retour sur investissement (cercle bleu) centré sur l’interface entre le cortex cellulaire et la membrane cellulaire pour examiner la dynamique du chiffre d’affaires de réticulants membrane actine tels que Ezrin. Il est représenté peu après le retour sur investissement a été exposé à l’impulsion de photoblanchiment. fluorescence totale dans les résultats de retour sur investissement des deux protéines liées à l’interface membrane-cortex et des protéines diffusant librement dans le cytoplasme comment récupérer des fichiers à partir un disque dur mac. Après photoblanchiment, la fluorescence dans la ROI récupère par diffusion de protéines fluorescentes (récupération diffusive) et par association / dissociation des protéines fluorescentes de la membrane ou du cortex (récupération réactive). Ces deux contributions peuvent être généralement séparés expérimentalement car ils se produisent généralement sur des échelles de temps très différentes linux récupérer des fichiers du mauvais disque dur. blanchies molécules sont représentées en gris, et les fluorescents sont indiquées en vert. Dans cette représentation, parfois court après l’impulsion de photoblanchiment, protéines liées à l’interface membrane cortex n’a pas eu suffisamment de temps pour se dissocier et diffuser hors du retour sur investissement, alors que les protéines qui diffusent librement dans le cytoplasme ont eu suffisamment de temps pour diffuser in / out du retour sur investissement. (B) Représentation schématique d’une expérience de photoblanchiment typique. Haut, le ROI et sa fluorescence sont représentés graphiquement par un cercle de couleur, gris indiquant fluorophores blanchies. En bas, graphique illustrant l’évolution de l’intensité de la fluorescence en fonction du temps. Dans une expérience typique, quelques images sont capturées avant photoblanchiment pour fournir une intensité de fluorescence de base. Le ROI est alors Photo-blanchissement (zone grisée) et est surveillée récupération dans la ROI (ligne noire). Dans un premier temps, la fluorescence augmente rapidement, mais après t f il atteint un plateau et la récupération peut être considérée comme complète. La mesure de l’évolution de l’intensité de fluorescence au fil du temps dans une expérience séparée dans la même cellule permet de déterminer la perte de fluorescence grâce à l’imagerie (ligne en pointillés). La fraction de particules qui récupère la fraction est appelée mobile, et la fraction immobile est la fluorescence initiale moins la fraction mobile. La fraction immobile est une combinaison de la fluorescence perdue par l’imagerie et la fraction des protéines qui ne tourne pas pendant la durée de l’expérience comment récupérer des fichiers sur la carte micro sd. Parfois suffisamment longues, la plupart des protéines doivent se remettre complètement. a.u., unités arbitraires.

(A) Culture de cellules sur des lamelles de 25 mm dans les puits d’une plaque à six puits. Transférer une lamelle couvre-objet sur le porte-échantillon avec une paire de pinces, en prenant soin de placer la lamelle dans la rainure centrale du support et visser fermement. Ensuite, ajouter 1 ml de milieu de formation d’image (étape 1-3). (B) Gauche, pour déterminer la hauteur sur laquelle le blanchiment se produit dans la direction z, pour choisir un retour sur investissement (par exemple, 6 × 2 pm dans 2 xy, à gauche) au milieu de la hauteur des cellules fixées et dans son cytoplasme récupérer le fichier visio corrompu. Régler la puissance du laser au maximum, l’eau de Javel et d’acquérir une z-pile pour mesurer la hauteur h de la zone blanchie (au milieu). La hauteur cible doit être le diamètre d de la région que vous souhaitez utiliser pour photoblanchiment. La baisse des puissances laser se traduira par de plus petites hauteurs et une puissance plus élevée dans les hauteurs plus grandes. A droite, l’intensité de la fluorescence en fonction de la taille en z comment récupérer des fichiers Mac. Dans la région dans laquelle la cellule a été Photo-blanchissement, la fluorescence a été réduite à la fluorescence de fond. La hauteur de la région Photo-blanchissement peut être estimée à partir de la distance entre les deux points où l’intensité est égale à 50% du maximum, qui est désignée par D sur le diagramme (étapes 9 et 10). (C) les exemples de schémas de choix de retour sur investissement. ROIs appropriés sont représentatifs de l’organite d’intérêt. Par exemple, dans ce panneau, la structure d’intérêt est le cortex actine sous-membranaire, un réseau de filaments d’actine (vert) liés à la membrane cellulaire (rouge). Top, le retour sur investissement est centrée sur le cortex dans une région avec fluorescence homogène. Pour déterminer l’étendue de la perte d’imagerie induite par fluorescence, une expérience séparée est réalisée dans la même cellule dans un retour sur investissement séparé, le retour sur investissement de perte (lROI). Le lROI doit être situé à proximité du ROI d’origine, mais assez loin pour éviter l’incorporation significative de particules qui ont quitté Photo-blanchissement le retour sur investissement. Moyen, mauvais choix de couvrir les zones ROIs non représentatifs de la structure cible. Par exemple, dans ce panneau, un retour sur investissement a été choisie, comprenant les zones plus claires dans le cortex cellulaire qui sont dus à l’autofluorescence, par exemple. Bas, pour évaluer les contributions à la récupération diffusantes de fluorescence dans le retour sur investissement, placer une plus petite région d’intérêt dans le cytoplasme (CYROI) dans le retour sur investissement de photoblanchiment et de mesurer l’évolution de la fluorescence au fil du temps (étapes 12, 15 et 16). (D) Le taux de trame optimal (points verts) rassemblera de nombreux points de données couvrant toute la durée sur laquelle la fluorescence récupère (courbe réelle de récupération, noir). Une fois que la récupération est terminée, la courbe de fluorescence dans le retour sur investissement devrait se joindre à la courbe de perte de fluorescence (ligne rose) comment récupérer des fichiers à partir d’un disque dur portable. taux de trame trop bas (points rouges) ne recueillent pas de données suffisantes pour le montage et perdre les détails de récupération (par exemple à des échelles de temps courtes). taux de trame trop élevé (points bleus) entraînent une perte excessive de fluorescence et par conséquent les processus de récupération obscurs qui se produisent à des échelles de temps longues ou qui ont de faibles amplitudes. Récupération doit être surveillée jusqu’à ce que la fluorescence dans le retour sur investissement atteint un plateau. laps de temps trop court (tirets gris) ne peuvent pas donner des informations sur les processus de récupération, ce qui contribue sur de longues périodes, et entraîner des fractions immobiles artificiellement élevés (étapes 11 et 12). (E) de temps caractéristique représentative de récupération en fonction du rayon de la zone de blanchiment pour un fluorophore dans le cytoplasme (en haut images de l’échantillon) et sur la membrane (images d’échantillon de fond). Le cytoplasme a été marqué avec EGFP, alors que la membrane a été marquée avec CellMask tache de la membrane plasmique vert selon le protocole du fabricant. Pour les deux colorants, le temps de récupération mis à l’échelle comme une fonction quadratique du rayon de la ROI r (ligne pointillée) dropbox récupérer les anciens fichiers. Les barres d’erreur indiquent s.d. (F) Le coefficient de diffusion calculé à partir des expériences présentées dans l’e est indépendante du rayon de la ROI. Les barres d’erreur indiquent s.d. a.u., unités arbitraires.

(A) La plage de données idéale pour ajustement de courbe commence à partir du premier point temporel après photoblanchiment et se prolonge jusqu’au point de temps auquel la récupération atteint son plateau (bleu lignes pointillées, Etape 27A (iv)). Si la récupération atteint son plateau avant que le temps écoulé se termine, le montage du tout le temps-lapse placera un poids excessif sur les processus de récupération qui agissent sur des échelles de temps plus longues, et cela peut conduire à la détermination erronée des paramètres de récupération. graphiques de récupération peuvent être utilisés pour estimer les paramètres d’ajustement initiaux. Pour une installation exponentielle unique, l’intensité de fluorescence normalisée lorsque la reprise a atteint un plateau est une bonne estimation de l’amplitude A (en pointillés ligne noire) comment récupérer les fichiers non enregistrés sur mac. Le temps caractéristique τ peut être estimée à partir du temps t 1/2 à laquelle la fluorescence a atteint 50% de son intensité initiale: τ = t 1/2 / ln (2) (zone rouge, étapes 2A (V-VI) et 2B (v-vi)). (B) Pour deux ajustements exponentiels, deux boîtes peuvent être tirées, comme le montre ce graphique: un pour des échelles de temps courtes et une pour de longues échelles de temps. La longueur et la largeur de chaque zone peut être utilisée comme une première estimation de τ 1, τ 2, A 1 et A 2 pour le montage (étape 27B (vii)). (C- e) l’exemple d’une courbe expérimentale équipée d’une (c), deux (d) ou trois fonctions exponentielles (e). Bons ajustements correspondent à la courbe de récupération à tous les points de temps, alors que les mauvaises crises dévient de façon significative à partir des données expérimentales. Montage des données expérimentales avec un conduit exponentielle unique à pauvres crises, avec l’ajustement déviant de manière significative à partir des données parfois courtes (encart, c). Lorsque les données sont aptes à deux exponentielles, un ajustement est réalisé visiblement mieux ce qui se traduit par un R 2 sensiblement plus élevée (d). Lorsque les données sont équipées de trois fonctions exponentielles, deux d’entre elles ont exactement les mêmes échelles de temps caractéristiques et les amplitudes (e). La somme de l’amplitude de ces deux fonctions exponentielles est égale à l’amplitude de la seconde fonction exponentielle dans un ajustement à deux exponentielle (étape 27B (vii)). (F) de tracé d’accélération logarithmique correspondant à la forme de la courbe expérimentale avec deux exponentielles (étape 28) récupérer le fichier ppt en ligne. Dans c- f, D i est la constante de diffusion de processus i, ω i ≈ 1 / τ i est le taux de rotation de processus i et A i est l’amplitude du processus i. a.u., unités arbitraires.

Correction en ligne 01 Juillet 2015 la version de cet article initialement publié, les fichiers décrits dans les méthodes supplémentaires ont été portées disparues et ont maintenant été mises en ligne et accessibles comme des informations complémentaires à la version publiée de l’article. L’erreur a été corrigée dans ce dossier à partir du 1er Juillet à 2015.