Une stratégie pour disséquer les architectures de recherche méthodes nature nature assemblées macromoléculaires native

Des cellules ou des tissus animaux sont broyés cryogéniquement en particules de taille micrométrique (poudres), qui sont dissous dans des tampons appropriés pour extraire efficacement les protéines tout en conservant les architectures des assemblages de protéines natives. Le complexe de protéine marquée GFP-(5-15 ug) est ensuite capturé par affinité par ultra-haute affinité, des billes non magnétiques réticulable conjugué nanobody. Le complexe de protéine est en perles réticulés par DSS, après quoi le complexe réticulé est éluée par LDS chauffées (de dodécylsulfate de lithium) tampon dénaturant et séparé par électrophorèse SDS-PAGE. Le complexe efficacement réticulé est en gel protéolysée pour générer les peptides réticulés, qui sont identifiés par MS à haute résolution. L’information obtenue peut être traduit en contraintes spatiales spécifiques de résidus pour le calcul de modèles de structure d’intégration.


souches de levure Rrp6-GFP et Ski7-GFP ont été cultivées au milieu de la phase logarithmique et distro récolté de récupération Linux. Les cellules ont été colorées avec de 2,5 ug / ml de DAPI pendant 20 minutes et on les lave avec du tampon PBS, et les signaux de GFP ont été visualisées en utilisant un microscope à fluorescence, comme décrit dans les procédés en ligne. Les images ont été traitées avec Adobe Photoshop. DIC, différentiel contraste d’interférence.

Les gels SDS-PAGE des complexes d’exosomes associés Ski7 Rrp6- et ont été colorées avec Sypro Ruby. Les protéines ont été visualisées en utilisant un système Fujifilm LAS-3000, et les intensités correspondantes des quatre bandes de protéines ont été mesurées par ImageJ pour calculer leurs stoechiométries par rapport à Rrp44. Les barres d’erreur représentent les écarts-types de quatre expériences indépendantes. La bande de gel à 20 kDa correspond à la fois LRP1 et MPP6 supprimé le logiciel de récupération de fichier vidéo téléchargement gratuit. Cependant, parce que la protéine LRP1 est dominant dans la bande, l’intensité de la protéine de MPP6 a été négligé pour la présente analyse stoechiométrique de associée Rrp6, exosome spécifique au noyau.

La figure 14 supplémentaire. Satisfaction réticuler et de fréquence de contact normalisé des cartes de (a) Rrp6-LRP1-exo10 et (b) des complexes d’exosomes Ski7-de exo10.

• complémentaire Figure 1: Séquences de protéines de la nanobodies 3K1K et LAG-16 et localisations des résidus de lysine sur la structure cristalline de PDB # 3K1K. (285 KB)

(A) Les alignements de séquences protéiques de 3K1K et LAG-16. Les résidus de lysine sont mis en évidence dans le cyan. CDR: région de détermination de complémentarité. les séquences CDR1, CDR2 et CDR3 sont codés par couleur en bleu, rose et orange, respectivement.

(B) Localisations des trois résidus de lysine sur la structure cristalline de Nanobodies PDB 3K1K, qui ont été mutée en arginine (R) ou la glutamine (Q) pour le présent travail libre récupération de fichiers flash. Les résidus de lysine sont présentés sous forme de sphères rouges.

(A) Les niveaux d’expression relatifs de type sauvage et lysineless nanobodies anti-GFP. Les niveaux d’expression de protéines sont normalisées par rapport au niveau d’expression de LAG-16 de type sauvage. UA, unité arbitraire.

(C) des mesures SPR K D de LaG16-2K / R. Nanobodies à différentes concentrations ont été injectées en triple pour l’analyse. Sensorgrammes de liaison ont été SPR traitées et analysées à l’aide du logiciel Manager ProteOn. Courbes ajustées par un modèle de Langmuir sont représentés en noir. RU, les unités de réponse iphone 4 logiciel de récupération de données télécharger gratuitement la version complète. L’axe des x est le temps de dissociation en quelques secondes.

• complémentaire Figure 3: Comparaison des efficacités de récupération du complexe APC / C réticulé par en interne généré des anticorps polyclonaux Ilama, le GAL-16 et la lysine-moins LAG-16 Nanobodies (2K / R) après en bourrelet réticulation suivi par dénaturation élution. (73 KB)

(A) coloration à l’argent de la réticulée complexe APC / C en bourrelet qui peut être élue par un tampon dénaturant. Des quantités égales de internes produites anticorps polyclonaux Ilama (poly), LAG-16 de type sauvage, et lysineless LAG-16-2K / R (2K / D) nanobodies ont été conjugués en parallèle à des billes magnétiques époxy. Les billes magnétiques conjuguées à l’anticorps ont été traités par l’agent de réticulation DSS pour bloquer les amines réactives résiduelles et ont ensuite été utilisés pour affinité complexe APC / C isolât (CDC16 en utilisant GFP-étiqueté). Le complexe isolé a été réticulé en perles (0,1 mM DSS). Après le bourrelet-réticulation, le complexe réticulé qui est lié de manière non covalente aux résines nanobody a été éluée par un tampon de LDS chaud (chauffé à 85 °). Le complexe protéique résultant a été soumis à une SDS-PAGE. Le complexe APC / C efficacement réticulé correspond à la région de haut poids moléculaire (gt; 350 kDa) du logiciel de récupération de fichier Windows Freeware gel 7. Une fraction de chaque échantillon a été visualisée par coloration à l’argent.

(B) Comparaison des taux de récupération du complexe de la protéine APC / C réticulé pouvant être éluée à partir de résines magnétiques conjuguées à des anticorps GFP. les régions de gel correspondant à la protéine étiquetée GFP CDC16 (~ 70-160 kDa pour le complexe APC / C non réticulé ou gt; 350 kDa pour le complexe APC / C réticulé) ont été produits en gel digéré par la trypsine et analysée par LC-MS. Les expériences ont été répétées trois fois de manière indépendante en utilisant des billes conjuguées à des anticorps fraîchement préparé (répétitions biologiques), et pour chaque répétition biologique trois répétitions analytiques ont été effectuées. Les intensités relatives de la protéine GFP-tagged CDC16 (qui représente la quantité relative du complexe) à partir de trois différents réactifs anti-GFP ont été quantifiés par MaxQuant (version 1.5) en utilisant la quantification sans étiquette (LFQ). Les intensités relatives de APC / C réticulé sont normalisées par rapport à la somme des intensités d’entrée de 2K / R.

• Figure complémentaire 4: gels SDS-PAGE de la Rrp6-GFP et des complexes d’exosomes associés GFP-Ski7 qui ont été capturés par affinité lysineless Nanobodies (111 KB)

Les bandes de protéines sur chaque gel de SDS-PAGE ont été coupées en tranches et digérées en gel. Les peptides digérés à partir de différentes bandes ont été rassemblées, dessalées et analysés par LC-MS. Les principales protéines correspondant aux bandes sont marquées

souches de levure Rrp6-GFP et Ski7-GFP ont été cultivées jusqu’à la phase mi-log et le logiciel de récupération de données récoltées en téléchargement gratuit avec fichier fissure. Les cellules ont été colorées avec 2,5 pg / ml de DAPI pendant 20 minutes et lavées avec du tampon PBS, et les signaux de GFP ont été visualisées en utilisant un microscope à fluorescence, comme décrit dans les procédés en ligne supprimé le logiciel de récupération de fichiers windows téléchargement gratuit 7. Les images ont été traitées avec Adobe Photoshop. DIC, le différentiel contraste d’interférence.

Les lignes bleues représentent des liaisons transversales DSS reliant deux résidus d’acides aminés à la portée de 30 Å, et des lignes rouges sont des liaisons transversales DSS qui sont plus de 44 Å. Le chiffre a été préparé en utilisant le logiciel UCSF Chimera.

• complémentaire Figure 7: euclidienne C α-C alpha distances des liaisons transversales sur les structures cristallines PDB 4IFD et PDB 2WP8 et une haute résolution représentant SM / SM du spectre réticuler. (243 KB)

a) euclidienne C α-C distances alpha des liaisons transversales sur les structures cristallines PDB 4IFD et PDB 2WP8. Les barres bleues représentent les distances mesurées réticuler la structure 4IFD, et la barre rose représente les distances mesurées réticuler la structure 2WP8. Les astérisques indiquent les liaisons croisées qui sont plus de 44 Å. b) Un spectre MS / MS à haute résolution de la réticulation DSS entre la lysine 497 et lysine de Rrp44 292 de Rrp45. Le C-C α α distance entre les résidus réticulés est de 60,6 Å sur la structure cristalline. Une échelle de HCD fragmentations se produit le long des liaisons peptidiques des deux chaînes peptidiques, et fragmentations sont marqués sous forme d’ions et d’ions b-y. Le résidu de methionine soulignée est oxydé. L’état de charge de cet ion peptidique est 5. L’astérisque désigne un ion immonium, qui est couramment observée dans les spectres de fragmentation de l’HCD.

• Figure complémentaire 8: RMSFs résidus spécifiques (des fluctuations de moyenne quadratique) des trois sous-unités d’exosomes de Lrp, Rrp6 et Ski7. (105 KB)

RMSFs spécifique au résidu de trois sous-unités d’exosomes de (a) LRP1, (b) Rrp6 et (c) Ski7 supprimé excel Récupération de fichier logiciel de téléchargement gratuit. L’axe des x des emplacements est chaque numéro de résidu individuel de la séquence de la protéine, et l’axe y est l’RMSF calculée en Å.

• La figure 9 complémentaire: Un spectre SM / SM à haute résolution de la « même résidu » cross-link sur lysine 565 de la sous-unité APC / C CDC27. (211 KB)

Une échelle de fragmentations de DCH se produit le long des liaisons peptidiques des deux chaînes de peptides et fragments sont marqués sous forme d’ions et d’ions b-y. L’état de charge de l’ion peptide sélectionné est 7 mot supprimé logiciel de récupération de fichiers Téléchargement Gratuit. Les astérisques comme dans la figure 8 supplémentaire.

Les complexes protéiques ont été capturés par affinité et réticulé en perles à diverses concentrations d’agent de réticulation DSS. Les complexes réticulés ont été éluées et séparées sur des gels de SDS-PAGE, et les complexes réticulés ont été colorés à l’argent pour la visualisation.

• complémentaire Figure 11: analyse SDS-PAGE de complexes d’exosomes purifiés à partir de lysats de cellules entières traitées avec différentes concentrations d’agent de réticulation DSS. (169 KB)

composants d’exosomes avec un poids moléculaire supérieur à 50 kDa sont marqués. composites de protéines exosomes capturé par affinité à partir de 0 et 5 mM traitement DSS ont été analysées par LC-MS. Les protéines ont ensuite été identifiés par X! Tandem, et leur abondance relative a été quantifiée par comptage des spectres.

Tous les sous-unités sont représentées par un ensemble de billes disposées soit dans des corps rigides correspondant à des parties structurées (segments bleus dans les bars) ou des chaînes flexibles correspondant à des parties inconnues / désordonnés (segments jaunes dans les bars). L’ensemble du complexe de exo10 a été maintenu rigide.

Les gels SDS-PAGE des complexes d’exosomes associés Ski7 Rrp6- et ont été colorées avec Sypro Ruby. Les protéines ont été visualisées en utilisant un système Fujifilm LAS-3000, et les intensités correspondantes des quatre bandes de protéines ont été mesurées par ImageJ pour calculer leurs stoechiométries par rapport à Rrp44. Les barres d’erreur représentent les écarts-types de quatre expériences indépendantes. La bande de gel à 20 kDa correspond à la fois LRP1 et MPP6 récupération des fichiers médico-légale logiciels libres. Cependant, parce que la protéine LRP1 est dominant dans la bande, l’intensité de la protéine de MPP6 a été négligé pour la présente analyse stoechiométrique de associée Rrp6, exosome spécifique au noyau.

• complémentaire Figure 14: la satisfaction de reticulation et des cartes de fréquences normalisées de contact de (a) Rrp6-LRP1-exo10 et (b) des complexes d’exosomes Ski7-de exo10. (163 KB)

Chaque boîte est une matrice à deux dimensions dont les axes x et y sont les indices des résidus des deux séquences des sous-unités des exosomes. Satisfait des liens croisés et liens croisés violés sont représentés par des cercles verts et orange, respectivement. La carte de fréquence normalisée de contact est représentée par des nuances de gris, où gris plus foncé représente contacts de résidus en résidus qui se produisent plus fréquemment dans le groupe de solutions.

• complémentaire Figure 15: Cartographie des liens croisés Beclin 1 sur la structure cristalline disponible (PDB 3Q8T) du domaine bobine-bobine (résidus 172-265). (124 KB)

Les résidus lysine sont représentés comme des sphères rouges, et les liaisons transversales entre les résidus de lysine sont représentées par des lignes noires. La figure a été préparé en utilisant UCSF Chimera.

Clustering analyse des complexes protéiques des exosomes (composites) qui sont isolés par affinité à partir des lysats de cellules entières qui sont traitées avec 0 mM et 5 mM de l’agent de réticulation DSS.

Les gels SDS-PAGE des complexes d’exosomes associés Ski7 Rrp6- et ont été colorées avec Sypro Ruby. Les protéines ont été visualisées en utilisant un système Fujifilm LAS-3000, et les intensités correspondantes des quatre bandes de protéines ont été mesurées par ImageJ pour calculer leurs stoechiométries par rapport à Rrp44. Les barres d’erreur représentent les écarts-types de quatre expériences indépendantes. La bande de gel à 20 kDa correspond à la fois LRP1 et MPP6. Cependant, parce que la protéine LRP1 est dominant dans la bande, l’intensité de la protéine de MPP6 a été négligé pour la présente analyse stoechiométrique de associée Rrp6, exosome spécifique au noyau.